IGV批量查看变异

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IGV批量查看变异并过滤

IGV可视化准备

Nature biotechnology文献：Integrative Genomics Viewer

Downloads IGV ;  igvtools为一些数据可视化预处理程序

PS:igv 要求java 1.8 ,安装java1.8可参考链接

export JAVA_HOME=/home/wangdong/softwares/java1.8/jdk1.8.0_172
export JRE_HOME=/home/wangdong/softwares/java1.8/jdk1.8.0_172/jre 
export PATH=$PATH:/home/wangdong/softwares/java1.8/jdk1.8.0_172/bin 
export CLASSPATH=./:/home/wangdong/softwares/java1.8/jdk1.8.0_172/lib:/home/wangdong/softwares/java1.8/jdk1.8.0_172/jre/lib

IGV可视化数据准备

  • 不是什么数据都可以拿IGV看的，参考基因组必须为FASTA格式；
  • IGV只是负责将比对结果可视化，并没有比对过程，所以不能直接载入reads；
  • 需要将待比对的reads与前面指定的参考基因组用bwa进行比对；
  • 比对后的sam文件也不能直接载入，要转bam；bam排序；bam建索引（可以一步完成）；

需要两个文件.bam文件和.bam.bai文件

IGV批量查看变异

生成批量查看.bat文件

IGV批量运行的.bat文件命令参数及例子：Controlling IGV through a Port ,   a batch file example    IGV-snapshot-automator项目

使用命令：
java -Xmx1024M -jar ~/bin/igv-2.3.52/igv.jar -b IGV_screenshot.bat

VNC Viewer使用

  VNC (Virtual Network Console)是虚拟网络控制台的缩写。它 是一款优秀的远程控制工具软件，由著名的 AT&T 的欧洲研究实验室开发的。VNC 是在基于 UNIX 和 Linux 操作系统的免费的开源软件。VNC基本上是由两部分组成：一部分是客户端的应用程序(vncviewer)；另外一部分是服务器端的应用程序(vncserver)。Download VNC Viewer ，解压后按照README安装即可

Linux环境VNC服务安装、配置与使用

工作流程：

  1. 服务器端启动VNC Server，使用命令vncserver,之后输入密码并确认，之后获得数字1，表示vncserver创建的第一个vnc viewer用户；
  2. 在win7的客户端创建连接即可

之后点击igv.sh运行igv,在Tools的Run Batch Script，导入.bat文件即可！

变异的过滤

  在对Func.refGene，ExonicFunc.refGene，1000g2015aug_eas等进行hard filter后，一般全外显子测序找到的突变依然还有一两百个，接下来需要通过直观的可视化，验证SNP/SNV calls和结构重排，进一步去除假阳性的结果。IGV Tutorial（推荐）

查看技巧

  1. File—>Load from Server可以加载许多tracks

  1. 在reads区右键可以选择不同的查看方式

  1. 可以同时开多个igv.sh或者将IGV_snapshots.bat文件合并，并删除掉除最后一个之外的所有exit语句

  2. maxPanelHeight 设置很重要，默认800，但是igv截图不全，所以设置为10000

通过命令行自动截图

服务器上vncserver源码下载链接,选择Generic scripts x64，然后下载即可，安装可查看README文件。具体可参考（1）vnc 源码安装； （2）linux命令：VNC服务的配置及使用

  • 开启vncserver
  • 设置环境变量DISPLAY: export DISPLAY=:1 (你vnc开的几就写几)
  • 修改igv.sh中-Xmx4000m，增大igv分配内存
  • igv.sh -b IGV_snapshots.bat

过滤标准

  1. 高质量的SNVs和SNPs要求在所有的reas中High base qualities，并且不能在reads的末端；
  2. Good mapping quality of reads, no strand bias, allele frequency consistent with heterozygous mutation

Important metrics for evaluating the validity of SNVs:

  • Coverage
  • Amount of support
  • Strand bias / PCR artifacts
  • Mapping qualities
  • Base qualities
  1. 通过Coverage track查看比对情况，没有比对上参考基因组的碱基将在Coverage track和data panel以不同颜色高亮显示；

  1. 低质量的碱基calls是半透明的（faint,semi-transparent）

区分SNP突变和错配：

  1. SNP突变如果是杂合，会在Coverage track处显示红蓝box,当鼠标悬停在上面时显示allele counts 和frequencies。可以在此处右键，选择sort alignments by > base查看，以此根据碱基的透明度确定SNP碱基call的质量；

  1. 而错配的情况在在Coverage track处是没有红蓝box的。通过在此处右键，选择shade base by quality使得用半透明颜色表示的低质量碱基全部高亮显示，方便查看；接着选择Sort alignments by > read strand，然后Color alignments by > read strand，以此确定是否存在stand bias。

Important metrics for evaluating SVs:

  • Coverage
  • Insert size
  • Read pair orientation

具体使用可查看：IGV Lecture - Long, from Broad Institute ，也包括了查看RNA-seq比对情况的操作

vncviewer 连接上后黑屏解决

参考：vnc viewer连接黑屏

（1）修改/home/wangdong/.vnc/xstartup文件
vi /home/wangdong/.vnc/xstartup

##如果使用的是gnome图像界面，则需要注释掉以下两行,
#xterm -geometry 80x24+10+10 -ls -title "$VNCDESKTOP Desktop" &
#twm &
##并添加以下这行：
gnome-session &

（2）改变xstartup的权限

chmod 777 /home/wangdong/.vnc/xstartup

ps: 首选在图形桌面用命令行运行igv.sh,再点击igv.sh运行

命令行下批量运行IGV

  • 开启Xmanager - Passive
  • 在Xshell5的Poperties—>Tunneling—–>Forward X11 connections to
  • 命令行下使用igv.sh -b IGV_snapshots.bat

igv命令行参数可查看：链接

ps: windows下需要提前安装好igv

参考

（1）可视化工具之 IGV 使用方法

（2）IGV_Batch_Screenshots.md

（3）如何使用VNC Viewer连接远程CentOS服务器

（4）Quick Visual Inspection Of Mapping Images For A List Of Regions

（5）Unable to adjust image height via batch script

（6）Xshell显示图形化界面

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