GATK3.8相关软件及文件准备

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体细胞拷贝数变异分析流程!

使用RNA-seq数据call变异

Calling variants in RNAseq

Forum （提问和搜索报错解决很有用）

Blog (包含历年的workshop材料，学习用得上)

Presentation slides and tutorial materials - Pretoria 2017（需要翻墙才能下载）

GATK3.8下载

GATK=GenomeAnalysisToolkit，最新稳定版为GATK3.8 （需要注册！）

电脑软件在投放市场前，需要有人测试一下，看看是不是有问题，在开发该软件的公司内部的由该公司内部人员测试的称为：alfa测试。alfa测试主要看有没有功能缺失或系统错误，alfa测试完后一般不会有大问题了，然后把软件拿给用户测试，称为：beta测试，主要是看用户对软件外观，使用方便等的反映。 如果beta1版用户反映有问题，拿到公司修改，改完后发布beta2版，还有不满意的地方，再改，再发布beta3版，直到用户满意，或正式版发布为止。

GATK4.Beta.5即为测试版

#解压：
tar -jxvf GenomeAnalysisTK-3.8-0.tar.bz2

Getting Started

（1）java版本要求大于1.8.x

java -version

（2）测试

java -jar /path/to/GenomeAnalysisTK.jar -h

（3）设置别名

alias gatk="/home/wangdong/softwares/GATK3.8/GenomeAnalysisTK.jar"

（4）下载java1.7版本，解压即可（MuTect1.1.7需要）

Java SE 7 Archive Downloads

（5）mutect下载安装

（6）其他软件及环境配置

Software packages

BWA
SAMtools
Picard
IGV
RStudio IDE and R libraries ggplot2 and gsalib

参考：(howto) Install all software packages required to follow the GATK Best Practices.

Reference sequence和annotation下载

（请务必使用GATK resource bundle提供的参考基因组相关文件非常重要！）

GATK resource bundle介绍：
http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/1213/whats-in-the-resource-bundle-and-how-can-i-get-it

GATK resource bundle FTP地址：
http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/1215/how-can-i-access-the-gsa-public-ftp-server

（1）使用Xftp5等FTP server登陆

location: ftp.broadinstitute.org/bundle
username: gsapubftp-anonymous
password:

（2）使用浏览器登陆

ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/

Reference sequence

ucsc.hg19.dict.gz
ucsc.hg19.fasta.fai.gz
ucsc.hg19.fasta.gz

How can I prepare a FASTA file to use as reference?

picard CreateSequenceDictionary R= hg19.fa O= hg19.dict

annotation

1000G_omni2.5.hg19.sites.vcf.idx
1000G_omni2.5.hg19.sites.vcf.idx
1000G_phase1.indels.hg19.sites.vcf
1000G_phase1.indels.hg19.sites.vcf.idx
hg19/1000G_phase1.snps.high_confidence.hg19.sites.vcf
hg19/1000G_phase1.snps.high_confidence.hg19.sites.vcf.idx
dbsnp_138.hg19.vcf
dbsnp_138.hg19.vcf.idx
hapmap_3.3.hg19.sites.vcf
hapmap_3.3.hg19.sites.vcf.idx
Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.sites.vcf
Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.sites.vcf.idx

dbSNP 用于去除部分候选突变，其在其他人中已经被观察到的，最有可能是胚系突变。因为提交给dbSNP数据库的突变验证水平很低，所以我们不能确定标记为胚系突变或者体细胞突变的标签是否可信。
相比之下，COSMIC是一个经过更高验证的资源，所以它基本上被用作白名单来“拯救”候选突变，否则这些候选突变将会因为在正常和/或dbSNP中而被去除。我们期望在dbSNP中被标记为somatic的任何东西都将在COSMIC中，所以我们可以依靠COSMIC来重新回收这些位点。
当前最好的已知indels集合将被用于局部重新比对（local realignment）（请注意，我们不再使用dbSNP）; 使用这两个文件：
- 1000G_phase1.indels.b37.vcf (currently from the 1000 Genomes Phase I indel calls)
- Mills_and_1000G_gold_standard.indels.b37.sites.vcf
If you run any GATK tool on a vcf that doesn’t have an index, it will automatically generate one for you, so knock yourself out。参考：generate an idx file for a vcf

GATK: Prepare Reference Files

参考： (howto) Prepare a reference for use with BWA and GATK

Prerequisites

Installed BWA
Installed SAMTools
Installed Picard

Steps

Generate the BWA index

bwa index -a bwtsw ucsc.hg19.fasta #-a bwtsw指定索引算法
Generate the Fasta file index

samtools faidx ucsc.hg19.fasta #将生成ucsc.hg19.fasta.fai 文件
Generate the sequence dictionary（也可直接用已下载的ucsc.hg19.dict文件）

java -jar picard.jar CreateSequenceDictionary \

REFERENCE=reference.fa \

OUTPUT=reference.dict

（更详细的可参考：链接）

Cosmic*.gz文件下载

COSMIC需要注册

下载

CosmicCodingMuts.vcf
CosmicNonCodingVariants.vcf

Cosmic.hg19.vcf文件生成

COSMIC and dbSNP files for MuTect

sortByRef.pl was part of https://github.com/amplab/smash

gunzip Cosmic*.gz
grep "^#" CosmicCodingMuts.vcf > VCF_Header
grep -v "^#" CosmicCodingMuts.vcf > Coding.clean
grep -v "^#" CosmicNonCodingVariants.vcf > NonCoding.clean
cat Coding.clean NonCoding.clean | sort -gk 2,2 | awk '{print "chr"$0}' | perl sortByRef.pl --k 1 - hg19UCSC.fa.fai > Cosmic.hg19
cat VCF_Header Cosmic.hg19 > Cosmic.hg19.vcf